RFLPs

RFLP es el acrónimo en inglés de Restriction Fragment Length Polimorfism que en castellano lo traducimos como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción.

Entendemos por RFLP aquel segmento de DNA, de tamaño variable entre individuos, que se encuentra entre dos secuencias de DNA que llamamos sitios de restricción porque, con esta técnica una enzima de restricción la reconoce y corta por estas secuencias. Dando lugar a fragmentos de restricción.

En un ejemplo gráfico, representamos un segmento de DNA con ambas cadenas complementarias de la doble hélice en su secuencia nucleotídica. En la cadena superior, que será la diana de nuestra sonda, tenemos subrayadas las secuencias de DNA que llamamos sitios de restricción. En negrita, tenemos la secuencia diana que reconocerá una sonda de DNA marcado. Una secuencia diana puede ser todo aquello a lo que una sonda complementaria puede unirse.

-          C A A T T C A G T C G T T A A T C G T A G C T -

-          G T T A A C T C A G C A A T T A G C A T C G A -

Hay dos mecanismos por los que el tamaño de un determinado fragmento de restricción puede variar.

1.       Tenemos una muestra (1) donde ampliamos un segmento de DNA y observamos que está segmentado por tres enzimas cercanas entre ellas (flechas en la figura inferior). La muestra (2) a sufrido una mutación en el sitio de restricción b por lo que este individuo solo presenta dos sitios de restricción, observando un único segmento entre ellos. La sonda detectara, en la muestra 1, únicamente uno de los dos segmentos, por ejemplo, entre los sitios de restricción b y c; mientras que en la muestra 2 va a detectar que el segmento entre ambos sitios de restricción es mucho más largo.

2.       Otra manera de obtener variaciones en la longitud de estos segmentos es por herencia. Como es bien conocido, todos heredamos dos copias de los genes, una copia viene de parte de nuestro padre y la otra copia, de nuestra madre, al igual que ellos, que heredaron ambas copias de sus respectivos progenitores. Supongamos la siguiente situación:

     Papá (azul) tiene dos RFLPs determinados de 4 (cian) y 7 (naranja) pb cada uno. Mamá (rosa), en esas dos copias del mismo RFLP tiene 3 (púrpura) y 5 (amarillo) pb. Las posibilidades de la descendencia (verde) serian las siguientes combinaciones:   4 y 5,  4 y 3, 7 y 5, 7 y 3 pb, tal y como se esquematiza en el dibujo anterior. De esta manera, podemos identificar personas, por ejemplo, en casos de paternidad.

La técnica es la siguiente:
La muestra de DNA se rompe en trozos (se digiere) por enzimas de restricción produciendo “fragmentos de restricción” los cuales se separan mediante electroforesis en gel de agarosa por sus diferencias en la longitud de los segmentos. Posteriormente se transfiere a una membrana por Southern blot. A continuación, se hibrida una sonda de DNA marcado para determinar la longitud de los fragmentos que son complementarios a la sonda. Un RFLP se produce cuando la longitud de un fragmento detectado varia éntrelos individuos. Cada fragmento se considera un alelo, por lo que puede ser usado en análisis genéticos.

http://homepage.smc.edu/hgp/tools.htm

A pesar que, actualmente es una técnica prácticamente obsoleta, fue la primera técnica de perfiles de DNA suficientemente asequible (económicamente hablando) como para observar una amplia aplicación.  

La mayor ventaja de este método es que podemos obtener resultados incluso de muestras de DNA degradadas, por ejemplo, cuando se extrae de restos óseos.

Sus mayores desventajas son que es lento y engorroso. Se requiere mucha cantidad de muestra de DNA y todo el proceso (marcaje de la sonda, fragmentación del DNA, electroforesis, transferencia, hibridación, lavado y autorradiografía) puede tomar hasta un mes de trabajo.