Microarrays de DNA
El análisis de DNA se realiza de forma rutinaria mediante marcadores STR (Short Tandem Repeats). Sin embargo, en muestras de DNA degradado, el análisis de SNPs en fragmentos pequeños puede ser una alternativa mejor, puesto que requiere menor cantidad de muestra que los STR.
Para optimizar la técnica de los SNPs se usa lo que llamamos microarrays de DNA (que podríamos traducir como chips o matrices de DNA). El método se basa en la amplificación por PCR de las regiones de interés del estudio, es decir, aquellas que contienen los SNPs que queremos analizar, se procede a la minisecuenciación en solución de la muestra de DNA. Los ddNTP (desoxiribonucleótidos) previamente marcados con fluorescencia se incorporan en el sitio de SNP en la minisecuenciación. Posteriormente se hibrida en una matriz (microarray) que puede ser de vidrio, plástico, silicio u otros materiales. En esta matriz, encontramos una especie de pocillos en lo que hay unas sondas de DNA monocatenario fijadas en el fondo. Cuando nuestras secuencias procesadas tienen complementariedad específica con las sondas de la matriz quedan unidas, mientras que las secuencias que presenten SNPs no complementarios no hibridarán y se perderán en el posterior lavado (para quitar los segmentos sobrantes). Los pocillos en los que ha tenido lugar esta hibridación secuencia – sonda emitirán fluorescencia, que puede ser observada mediante microscopios que permiten ver fluorescencia como el microscopio confocal o mediante láser. También existen máquinas que hacen la lectura de la fluorescencia directa, muy útil cuando utilizamos fluorescencias de diferentes colores, ya que el análisis es automático y, además, cuantifican la intensidad de la señal, útil cuando la fluorescencia se ha perdido* parcialmente.
Figura 1. Proceso de análisis de SNPs por microarrays de DNA. En el resultado (5) se observa un resultado real de una prueba por microarrays, en el cual se distinguen diferentes colores de fluorescencia indicando SNPs diferentes.
Con esta técnica es posible determinar diferentes SNPs y luego realizar una comparación de las zonas de hibridación, ya sea de un sospechoso con el material encontrado en la escena de un crimen o bien para determinar casos de disputa legal de paternidad.
Las ventajas de este método son principalmente el hecho que están muy automatizadas y robotizadas, aminorando la manipulación de las muestras, en un solo proceso se pueden analizar un gran número de SNPs diferentes, tienen una alta reproducibilidad (se puede repetir varias veces el proceso y los resultados no serán significativamente diferentes), son muy específicas gracias al uso de secuencias cortas.
También presentan algunas limitaciones, las más importante es que la automatización y robotización requiere equipamiento especializado, que es muy caro. En general, es un método caro de análisis.
*La pérdida de fluorescencia puede ocurrir por exposición del compuesto fluorescente a la luz. Por mecanismos físicos, cuando una substancia fluorescente se expone a la luz va perdiendo potencia de emisión, por lo que es importante proteger estos componentes con papel de plata o botes oscuros. En caso que ocurra un desgaste de fluorescencia, con estas máquinas se puede detectar, la mayoría de veces la fluorescencia emitida.