VNTRs
VNTR, siglas en inglés de Variable Number of Tandem Repeats, más conocidas como minisatélites, que son repeticiones de secuencias de entre 6-25 nucleótidos que incluyen miles de pares de bases, que se utilizan como marcadores moleculares. El número de repeticiones de estas secuencias, como bien indica su nombre, es variable.
La técnica de detección de los VNTR se puede realizar por hibridación del DNA o por técnicas de PCR.
El mecanismo de la técnica por hibridación es prácticamente igual a la técnica de RFLPs, siendo este la digestión de las muestras de DNA mediante enzimas de restricción, para posteriormente separar los fragmentos mediante electroforesis. Después se transfiere a una membrana (Southern blot) y se detectan los VNTR mediante sondas.
La base molecular para la identificación también es la misma que con los RFLPs: la secuencia de DNA es igual entre los diferentes individuos, lo que nos hace diferentes son las veces que estas secuencias se repiten.
Figura 1. En este esquema tenemos representado gráficamente y de forma muy básica cómo podemos diferenciar los individuos mediante VNTRs o minisatélites (también sería un ejemplo válido para los RFLPs). En la imagen se puede observa cuatro cromosomas (rojo, amarillo, verde y cian) de tres individuos distintos (individuos A, B y C). Los recuadros azules representan la secuencia, por ejemplo, -CAGGTGGCCTAAATGCGC-, repetida varias veces. Vemos que estas secuencias están repartidas por los diferentes cromosomas del genoma pero se repite un número diferente de veces tanto entre los distintos cromosomas de un individuo como entre los distintos individuos. Algunas de las repeticiones pueden coincidir entre diferentes individuos, lo que nos daría una relación de parentesco entre ellos.
La diferencia básica y principal entre la técnica de RFLPs y VNTRs la encontramos en el tipo de sonda que se usa para cada una de ellas. En la detección de VNTRs las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de estos VNTRs o minisatélites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma se detectan simultáneamente. Por el contrario, en los RFLPs, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma, por lo que se detecta un locus o pocos loci cada vez.
También podemos analizar los VNTRs mediante PCR. Mediante esta técnica se amplifican los segmentos del genoma que contienen variaciones en el número de repeticiones utilizando primers o iniciadores que flanqueen las secuencias de los VNTRs. Una vez amplificado el DNA, se separan los fragmentos por electroforesis y se tiñen con una sustancia química, generalmente bromuro de etidio, o técnicas análogas. Actualmente, es más frecuente analizar los VNTRs mediante PCR que por hibridación, gracias a los grandes avances en el diseño de los primers.
Entre las ventajas de la técnica de VNTRs encontramos que son marcadores que permiten la visualización simultánea de diversas regiones del genoma, dónde se hayan estas secuencias.
Su gran limitación, al igual que ocurre con los RFLPs, es que es una técnica lenta, engorrosa y se requieren cantidades considerables de muestra para obtener resultados fiables.